Dithiothreitol (DTT) huwa aġent ta 'tnaqqis użat komunement, magħruf ukoll bħala l-addittiv aħdar il-ġdid.Huwa kompost organiku molekulari żgħir b'żewġ gruppi mercaptan (-SH).Minħabba l-proprjetajiet ta 'tnaqqis u l-istabbiltà tiegħu, id-DTT tintuża ħafna f'esperimenti ta' bijokimika u bijoloġija molekulari.
Ir-rwol ewlieni tad-DTT huwa li jnaqqas il-bonds tad-disulfide fil-proteini u bijomolekuli oħra.Ir-rabta tad-disulfide hija parti importanti mit-tiwi u l-istabbiltà tal-proteini, iżda taħt ċerti kundizzjonijiet sperimentali, bħal analiżi SDS-PAGE riduċibbli, rikombinazzjoni u tiwi tal-proteini, huwa meħtieġ li titnaqqas ir-rabta tad-disulfide għal żewġ gruppi thiol biex tiżvela l-istruttura spazjali ta ' il-proteina.DTT jista 'jirreaġixxi ma' bonds disulfide biex inaqqashom għal gruppi mercaptan, u b'hekk tiftaħ l-istruttura spazjali tal-proteina u tagħmilha faċli biex tiġi analizzata u mmanipulata.
DTT jista 'jintuża wkoll biex jipproteġi l-attività u l-istabbiltà tal-enżimi.F'xi reazzjonijiet katalizzati mill-enżimi, l-attività tal-enzima tista 'titnaqqas mill-ossidant.DTT jista 'jirreaġixxi ma' ossidanti biex inaqqashom għal sustanzi li ma jagħmlux ħsara, u b'hekk jipproteġu l-attività u l-istabbiltà tal-enzima.
Meta mqabbel ma 'aġenti ta' tnaqqis tradizzjonali bħal β-mercaptoethanol (β-ME), DTT huwa meqjus bħala aġent ta 'tnaqqis aktar sigur u aktar stabbli.Huwa mhux biss stabbli f'soluzzjoni milwiema, iżda jżomm ukoll il-proprjetajiet ta 'tnaqqis tiegħu taħt temperatura għolja u kondizzjonijiet ta' bażi ta 'aċidu.
L-użu tad-DTT huwa relattivament sempliċi.B'mod ġenerali, id-DTT jinħall f'buffer xieraq u mbagħad jiġi miżjud mas-sistema sperimentali.L-aħjar konċentrazzjoni tad-DTT jeħtieġ li tiġi determinata skont l-esperiment speċifiku, u ġeneralment tintuża fil-medda ta '0.1-1mM.Konċentrazzjonijiet aktar baxxi jistgħu jnaqqsu l-effetti avversi fuq it-tkabbir taċ-ċelluli u jistgħu jnaqqsu ċ-ċitotossiċità minħabba l-espressjoni żejda tal-proteini fil-mira.Konċentrazzjonijiet ogħla jistgħu jikkawżaw piż metaboliku eċċessiv taċ-ċelluli, li jaffettwaw it-tkabbir taċ-ċelluli u l-effiċjenza tal-espressjoni.
Il-mod biex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni ottimali jista 'jkun li jiġi evalwat il-livell ta' espressjoni tal-proteina fil-mira billi twettaq testijiet ta 'induzzjoni IPTG f'konċentrazzjonijiet differenti.Testijiet ta’ kultura fuq skala żgħira jistgħu jsiru bl-użu ta’ firxa ta’ konċentrazzjonijiet IPTG (eż. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, eċċ.) u l-effett tal-espressjoni f’konċentrazzjonijiet differenti jista’ jiġi evalwat billi jiġi identifikat il-livell ta’ espressjoni tal-proteina fil-mira (eż. Western skoperta blot jew fluworexxenza).Skont ir-riżultati sperimentali, il-konċentrazzjoni bl-aħjar effett ta 'espressjoni ġiet magħżula bħala l-aħjar konċentrazzjoni.
Barra minn hekk, tista 'wkoll tirreferi għal-letteratura rilevanti jew l-esperjenza ta' laboratorji oħra biex tifhem il-firxa ta 'konċentrazzjoni IPTG użata b'mod komuni taħt kundizzjonijiet sperimentali simili, u mbagħad tottimizza u taġġusta skont il-ħtiġijiet sperimentali.
Huwa importanti li wieħed jinnota li l-konċentrazzjoni ottimali tista 'tvarja skont sistemi ta' espressjoni differenti, proteini fil-mira, u kundizzjonijiet sperimentali, għalhekk huwa aħjar li tottimizza fuq bażi ta 'każ b'każ.
Fil-qosor, DTT huwa aġent li jnaqqas li jintuża b'mod komuni li jista 'jintuża biex inaqqas il-bonds tad-disulfide fil-proteini u bijomolekuli oħra u biex jipproteġi l-attività u l-istabbiltà tal-enżimi.Ġie użat ħafna f'esperimenti ta 'bijokimika u bijoloġija molekulari.
Ħin tal-post: Settembru-28-2023