Id-dithiothreitol (DTT) huwa aġent li jnaqqas li jintuża komunement, magħruf ukoll bħala l-addittiv ekoloġiku l-ġdid. Huwa kompost organiku molekulari żgħir b'żewġ gruppi mercaptan (-SH). Minħabba l-proprjetajiet li jnaqqsu u l-istabbiltà tiegħu, id-DTT jintuża ħafna fl-esperimenti tal-bijokimika u l-bijoloġija molekulari.
Ir-rwol ewlieni tad-DTT huwa li jnaqqas il-bonds tad-disulfid fil-proteini u bijomolekuli oħra. Il-bond tad-disulfid huwa parti importanti mit-tiwi u l-istabbiltà tal-proteini, iżda taħt ċerti kundizzjonijiet sperimentali, bħall-analiżi SDS-PAGE li tista' titnaqqas, ir-rikombinazzjoni u t-tiwi tal-proteini, huwa meħtieġ li l-bond tad-disulfid jitnaqqas għal żewġ gruppi thiol biex tinħall l-istruttura spazjali tal-proteina. Id-DTT jista' jirreaġixxi mal-bonds tad-disulfid biex inaqqashom għal gruppi mercaptan, u b'hekk jiftaħ l-istruttura spazjali tal-proteina u jagħmilha faċli biex tiġi analizzata u mmanipulata.
Id-DTT jista' jintuża wkoll biex jipproteġi l-attività u l-istabbiltà tal-enzima. F'xi reazzjonijiet katalizzati mill-enzima, l-attività tal-enzima tista' titnaqqas mill-ossidant. Id-DTT jista' jirreaġixxi mal-ossidanti biex inaqqashom għal sustanzi li ma jagħmlux ħsara, u b'hekk jipproteġi l-attività u l-istabbiltà tal-enzima.
Meta mqabbel ma' aġenti tradizzjonali li jnaqqsu bħal β-mercaptoethanol (β-ME), id-DTT huwa kkunsidrat bħala aġent li jnaqqas aktar sikur u stabbli. Mhux biss huwa stabbli f'soluzzjoni akwea, iżda jżomm ukoll il-proprjetajiet li jnaqqsu tiegħu taħt temperatura għolja u kundizzjonijiet aċidu-bażiċi.
L-użu tad-DTT huwa relattivament sempliċi. B'mod ġenerali, id-DTT jinħall f'buffer xieraq u mbagħad jiżdied mas-sistema sperimentali. Il-konċentrazzjoni ottimali tad-DTT teħtieġ li tiġi ddeterminata skont l-esperiment speċifiku, u ġeneralment tintuża fil-medda ta' 0.1-1mM. Konċentrazzjonijiet aktar baxxi jistgħu jnaqqsu l-effetti avversi fuq it-tkabbir taċ-ċelluli u jistgħu jnaqqsu ċ-ċitotossiċità minħabba l-espressjoni żejda tal-proteini fil-mira. Konċentrazzjonijiet ogħla jistgħu jikkawżaw piż metaboliku eċċessiv fuq iċ-ċelluli, li jaffettwa t-tkabbir taċ-ċelluli u l-effiċjenza tal-espressjoni.
Il-mod kif tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni ottimali jista' jkun li jiġi evalwat il-livell ta' espressjoni tal-proteina fil-mira billi jsiru testijiet ta' induzzjoni tal-IPTG f'konċentrazzjonijiet differenti. Testijiet ta' kultura fuq skala żgħira jistgħu jsiru bl-użu ta' firxa ta' konċentrazzjonijiet tal-IPTG (eż. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, eċċ.) u l-effett tal-espressjoni f'konċentrazzjonijiet differenti jista' jiġi evalwat billi jiġi skopert il-livell ta' espressjoni tal-proteina fil-mira (eż. Western blot jew skoperta tal-fluworexxenza). Skont ir-riżultati sperimentali, il-konċentrazzjoni bl-aħjar effett ta' espressjoni ntgħażlet bħala l-konċentrazzjoni ottimali.
Barra minn hekk, tista' wkoll tirreferi għal-letteratura rilevanti jew l-esperjenza ta' laboratorji oħra biex tifhem il-medda ta' konċentrazzjoni tal-IPTG użata b'mod komuni taħt kundizzjonijiet sperimentali simili, u mbagħad tottimizza u taġġusta skont il-ħtiġijiet sperimentali.
Huwa importanti li wieħed jinnota li l-konċentrazzjoni ottimali tista' tvarja skont sistemi ta' espressjoni differenti, proteini fil-mira, u kundizzjonijiet sperimentali, għalhekk l-aħjar li tiġi ottimizzata fuq bażi ta' każ b'każ.
Fil-qosor, id-DTT huwa aġent li jnaqqas li jintuża b'mod komuni u li jista' jintuża biex inaqqas il-bonds tad-disulfid fil-proteini u bijomolekuli oħra u biex jipproteġi l-attività u l-istabbiltà tal-enzimi. Intuża ħafna f'esperimenti tal-bijokimika u l-bijoloġija molekulari.
Ħin tal-posta: 28 ta' Settembru 2023