IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) huwa analogu tas-sottostrat tal-β-galactosidase, li huwa induċibbli ħafna. Taħt l-induzzjoni tal-IPTG, l-induttur jista' jifforma kumpless mal-proteina repressur, sabiex il-konformazzjoni tal-proteina repressur tinbidel, sabiex ma tkunx tista' tiġi kkombinata mal-ġene fil-mira, u l-ġene fil-mira jiġi espress b'mod effiċjenti. Allura kif għandha tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni tal-IPTG waqt l-esperiment? Iktar ma jkun kbir aħjar?
L-ewwel, ejja nifhmu l-prinċipju tal-induzzjoni tal-IPTG: L-operon (element) tal-lattożju ta' E. coli fih tliet ġeni strutturali, Z, Y, u A, li jikkodifikaw β-galactosidase, permease, u acetyltransferase, rispettivament. lacZ jidrolizza l-lattożju fi glukożju u galattożju, jew f'allo-lattożju; lacY jippermetti li l-lattożju fl-ambjent jgħaddi mill-membrana taċ-ċellula u jidħol fiċ-ċellula; lacA jittrasferixxi l-grupp aċetil minn acetyl-CoA għal β-galattoside, li jinvolvi t-tneħħija tal-effett Tossiku. Barra minn hekk, hemm sekwenza operattiva O, sekwenza tal-bidu P u ġene regolatorju I. Il-kodiċi tal-ġene I huwa proteina repressur li tista' torbot mal-pożizzjoni O tas-sekwenza tal-operatur, sabiex l-operon (meta) jiġi repress u mitfi. Hemm ukoll sit ta' rbit għall-proteina tal-attivatur tal-ġeni kataboliċi - is-sit ta' rbit CAP 'il fuq mis-sekwenza tal-bidu P. Is-sekwenza P, is-sekwenza O u s-sit ta' rbit CAP flimkien jikkostitwixxu r-reġjun regolatorju tal-operon lac. Il-ġeni li jikkodifikaw it-tliet enzimi huma regolati mill-istess reġjun regolatorju biex tinkiseb l-espressjoni kkoordinata tal-prodotti tal-ġeni.
Fin-nuqqas ta' lattożju, l-operon (meta) lac jinsab fi stat ta' ripressjoni. F'dan il-ħin, ir-repressur lac espress mis-sekwenza I taħt il-kontroll tas-sekwenza tal-promotur PI jingħaqad mas-sekwenza O, li jipprevjeni l-RNA polymerase milli torbot mas-sekwenza P u jinibixxi l-bidu tat-traskrizzjoni; meta jkun hemm lattożju, l-operon (meta) lac jista' jiġi indott. F'din is-sistema ta' operon (meta), l-induttur reali mhuwiex il-lattożju nnifsu. Il-lattożju jidħol fiċ-ċellula u jiġi katalizzat minn β-galactosidase biex jiġi kkonvertit f'allolactose. Dan tal-aħħar, bħala molekula induttur, jingħaqad mal-proteina repressur u jibdel il-konformazzjoni tal-proteina, li jwassal għad-dissoċjazzjoni tal-proteina repressur mis-sekwenza O u t-traskrizzjoni. L-isopropylthiogalactoside (IPTG) għandu l-istess effett bħall-allolactose. Huwa induttur qawwi ħafna, li mhux metabolizzat mill-batterji u huwa stabbli ħafna, għalhekk jintuża ħafna fil-laboratorji.
Kif tiddetermina l-konċentrazzjoni ottimali ta' IPTG? Ħu E. coli bħala eżempju.
Ir-razza ġenetikament inġinerizzata ta' E. coli BL21 li fiha l-pGEX rikombinanti pożittiv (CGRP/msCT) ġiet inokulata f'mezz likwidu LB li fih 50μg·mL-1 Amp, u kkultivata matul il-lejl f'temperatura ta' 37°C. Il-kultura ta' hawn fuq ġiet inokulata f'10 fliexken ta' 50mL ta' mezz likwidu LB frisk li fihom 50μg·mL-1 Amp fi proporzjon ta' 1:100 għall-kultura ta' espansjoni, u meta l-valur OD600 kien 0.6~0.8, IPTG ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali. Din hija 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Wara l-induzzjoni fl-istess temperatura u l-istess ħin, ittieħed 1 mL tas-soluzzjoni batterjali minnha, u ċ-ċelloli batterjali nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni u ġew soġġetti għal SDS-PAGE biex tiġi analizzata l-influwenza ta' konċentrazzjonijiet differenti ta' IPTG fuq l-espressjoni tal-proteina, u mbagħad tintgħażel il-konċentrazzjoni ta' IPTG bl-akbar espressjoni tal-proteina.
Wara esperimenti, jinstab li l-konċentrazzjoni ta' IPTG mhijiex kbira kemm jista' jkun. Dan għaliex l-IPTG għandu ċerta tossiċità għall-batterji. Jekk tinqabeż il-konċentrazzjoni, iċ-ċellula tinqatel ukoll; u ġeneralment, nittamaw li iktar ma jkun hemm proteina solubbli espressa fiċ-ċellula, aħjar ikun, iżda f'ħafna każijiet meta l-konċentrazzjoni ta' IPTG tkun għolja wisq, ammont kbir ta' inklużjonijiet jiġi ffurmat fil-ġisem, iżda l-ammont ta' proteina solubbli jonqos. Għalhekk, l-aktar konċentrazzjoni xierqa ta' IPTG ħafna drabi ma tkunx akbar aħjar, iżda iktar ma tkun baxxa l-konċentrazzjoni.
L-iskop tal-induzzjoni u l-kultivazzjoni ta' razez ġenetikament inġinerizzati huwa li jiżdied ir-rendiment tal-proteina fil-mira u jitnaqqsu l-ispejjeż. L-espressjoni tal-ġene fil-mira mhux biss hija affettwata mill-fatturi tar-razza stess u l-plażmid tal-espressjoni, iżda wkoll minn kundizzjonijiet esterni oħra, bħall-konċentrazzjoni tal-induttur, it-temperatura tal-induzzjoni u l-ħin tal-induzzjoni. Għalhekk, b'mod ġenerali, qabel ma proteina mhux magħrufa tiġi espressa u ppurifikata, huwa aħjar li jiġu studjati l-ħin tal-induzzjoni, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-IPTG sabiex jintgħażlu l-kundizzjonijiet xierqa u jinkisbu l-aħjar riżultati sperimentali.
Ħin tal-posta: 31 ta' Diċembru 2021